Насколько хорошо вы знаете свои камеры роста? Тестирование на камерный эффект с использованием свойств растений (Часть 3)

Методы

Семена Vicia faba 'Aquadulce Claudia' высеивали индивидуально в горшки емкостью 0,5 л с многоцелевым компостом . Через 14 дней рассаду пересадили в горшки объемом 1,5 л. Восемьдесят случайно выбранных Vicia Faba Растения выращивали в восьми камерах для выращивания растений в центре Программы экспериментальных атмосфер и климата UCD (PÉAC) на станции экологических исследований. Перед началом эксперимента все камеры были полностью очищены, чтобы обеспечить равномерную передачу и отражение света, а все лампочки были заменены. Использовались два типа лампочек: шестнадцать металлогалогенных ламп (400 Вт, высокая мощность с равномерным импульсным пуском) и шестнадцать перламутровых ламп накаливания (100 Вт, номинальная мощность 1200 люмен). Во всех камерах было одинаковое количество и расположение лампочек. Спектр света во всех камерах измерялся с помощью светового спектрометра, чтобы убедиться, что качество света не является причиной эффекта камеры. Во всех камерах моделировались одинаковые условия: фотопериод 16/8 ч (06.00–10.00, освещенность увеличивается от 0 до 600 мкмоль м^-2 с^-1; 10.00–18.00, освещенность 600 мкмоль м^-2 с^-1; 18.00–22.00, свет снижен с 600 до 0 мкмоль м^-2 с^-1); температура 25°С в полдень и 15°С ночью; 390 частей на миллион ₂; Влажность 65 % (табл. 1). Каждое растение получало 200 мл воды каждые 2 дня в течение первых 3 недель и по 400 мл каждые 2 дня в дальнейшем. В ходе эксперимента ежедневно контролировали количество цветков (значения представляют общее количество цветков в период роста). Через тридцать дней после начала эксперимента на самом молодом полностью раскрывшемся листе каждого растения проводили измерения газообмена и флуоресценции хлорофилла. Эксперимент проводился в течение 35 дней, после чего стебли растений отделяли от корней на уровне почвы и взвешивали (сырой вес). Полностью развернувшиеся зрелые листья собирали для анализа изотопа δ¹³ C, плотности жилок и плотности устьиц.

Очистка и окрашивание листьев для определения плотности устьиц и плотности жилок

Листья обрабатывали по протоколу Берлина и Микше. Листья очищали 5% раствором NaOH, трижды промывали дистиллированной водой, затем помещали на ночь в 1% раствор хлорной извести. Листья еще раз трижды промывали дистиллированной водой и пропускали через серию этанола (30, 50, 70, 100 %). Затем их окрашивали сафранином О и Fast Green, а затем снова пропускали через серию этанола (100, 70, 50, 30 %) в дистиллированную воду и монтировали на предметные стекла с использованием глицерин-желатиновой монтажной среды.

Плотность устьиц

Четыре изображения кутикулы каждого листа (по одному листу на растение, десять растений на камеру) были получены при 200-кратном увеличении с использованием микроскопа и программное обеспечение для обработки цифровых изображений. На каждое изображение накладывался квадрат площадью 0,09 мм. Плотность устьиц подсчитывали в пределах этого квадрата с использованием программного обеспечения в соответствии с протоколом Пула и Куршнера. Четыре отсчета на лист усреднялись, и это значение использовалось для статистического анализа.

Плотность жилок

Изображения трех срезов листьев площадью 1,25 мм² каждый получали при 50-кратном увеличении с использованием микроскопа с прикрепленной камерой и программным обеспечением для обработки цифровых изображений. Плотность мелких жилок листа (четвертичных и свободных концов) измеряли с помощью программного обеспечения на основе 120 изображений (один лист на растение, пять растений на камеру).

Стабильные изотопы углерода

Собирали по одному листу с каждого растения и по пять растений на камеру, сушили при 45°C и измельчали до тонкого однородного порошка. Образцы листьев анализировали на δ¹³ C с использованием элементного анализатора, соединенного с масс-спектрометром соотношения изотопов в Центре стабильных изотопов Калифорнийского университета в Дэвисе, США. Анализ образцов включал 10% повторность (один образец из десяти анализировали дважды для проверки точности). Значения изотопа δ выражены относительно международных стандартов, где δ = (образец R – стандарт R/стандарт R) × 1000 и R = соотношение содержания изотопов (т.е. ¹³C/ ¹²C). Инструментальная погрешность: ±0,03 ‰ (стандартное отклонение).

Измерения газообмена

Чистая скорость фотосинтеза (A_n) и устьичная проводимость (g_s) регистрировались на месте, начиная с 30 дней после начала эксперимента в камере. Измерения проводились с использованием газоанализатора, оснащенной измерительным окном площадью 1,7 см², на самом молодом, полностью раскрывшемся листе каждого растения между 9:00 и 12:00. Несмотря на то, что прибор позволяет манипулировать светом, влажностью, CO₂ и температура, эти факторы окружающей среды не контролировались; вместо этого измерения проводились в камерных условиях, чтобы оценить поведение растений на месте. Для этого с зонда снимали светодиодную головку, чтобы измерения проводились при интенсивности освещения ростовой камеры ≈600 мкмоль м^-2 s^-2. Кроме того, концентрация CO₂ (390 мкмоль моль^-1) и парциальное давление водяного пара (19,7 ± 1,3 мбар), использованные во время измерений, были идентичны тем, которые испытывали растения на месте. В этих условиях средняя температура листа составила 24,3 ± 0,7 °С, дефицит давления пара — 0,85 ± 1,6 кПа. При зажиме листа в кювете измерения проводились только после полной стабилизации А_n и g_s, что обычно занимало 3–5 мин.

Измерения флуоресценции

Измерения флуоресценции хлорофилла проводили на самом молодом, полностью развернувшемся листе каждого растения, начиная с 30 дней после начала обработки в камере роста растений. После адаптации листьев к темноте в течение 1 часа флуориметр непрерывного возбуждения использовался для измерения переходных процессов быстрой флуоресценции хлорофилла а. Насыщающий свет (≈3500 мкмоль м^-2 s^-1) обеспечивался одним красным светодиодом высокой интенсивности (пик при 627 нм), а значения флуоресценции хлорофилла записывались от 10 мкс до 1 с со скоростью сбора данных 10⁵, 10⁴, 10³, 10² и 10¹ показания в интервалах времени 10–300 мкс, 0,3–3 мс, 3–30 мс, 30–300 мс и 0,3–1 с соответственно. Кардинальные точки зарегистрированной кинетики полифазной флуоресценции [кривые OJIP, кардинальные точки: значение флуоресценции при 20 мкс ( F_o), значение флуоресценции при 300 мкс ≤ ( F_{300 мкс}), значение флуоресценции при 2 мс ( F_J), значение флуоресценции при 30 мс ( FI ) и максимальная интенсивность флуоресценции ( F_m)] затем использовались для расчета следующих параметров в соответствии с JIP-тестом, расширенным для включения эффекта событий, связанных с конечными акцепторами электронов Фотосистемы I.

Методы регистрации

Индивидуальное количество цветков регистрировали еженедельно. Цветки состоят из одного стандартного, двух крыльевых и двух килевых лепестков; Когда на соцветии появлялся каждый новый цветок, стандартный лепесток маркировался, чтобы один и тот же цветок не регистрировался дважды с течением времени. Общее количество цветков на соцветие и на растение регистрировали на протяжении всего эксперимента.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился в R (v.3.1.1). Там, где данные были нормально распределены, выполнялся однофакторный дисперсионный анализ. Критерий Крускала-Уоллиса для равных медиан был выполнен для непараметрических данных. Апостериорные тесты включали: тест Тьюкиса попарного множественного сравнения; критерий парного множественного сравнения Даннета-Тьюки-Крамера; и парный тест Манна–Уитни; каждый из них имеет корректировку уровня ложного обнаружения (FDR) для учета множественных сравнений.

Содержание

Часть 1. Предпосылки. Результаты и обсуждения.

Часть 2. Результаты и обсуждения (продолжение).

Часть 3. Методы